《天狼星行动》讲述了1941年抗日战争时期，一支代号“天狼星”的秘密行动小组深入敌占区执行特殊任务的故事。这支由国共两党精英组成的队伍，以摧毁日军“731”部队的细菌武器研发基地为核心目标，在危机四伏的环境中展开了一系列惊心动魄的斗争。
剧情以女主角陈秋雪为线索展开。她原是北平医科大学的学生，因家人被日军杀害而投身抗日，凭借冷静的头脑和医学知识加入“天狼星”。小组由经验丰富的国民党军官廖武担任队长，成员包括擅长格斗的江湖艺人阿玉、精通机械的工程师李银龙、以及潜伏在日军内部的情报员沈柱城。五人小队看似性格迥异，却在共同的使命中形成默契。
行动初期，小队伪装身份潜入哈尔滨，目标是获取日军基地的布防图。过程中，他们遭遇日军特高课课长松井的严密追查。松井狡猾多疑，利用叛徒信息设下陷阱，导致小队多次陷入险境。在一次营救被捕同志的行动中，沈柱城暴露身份，为掩护队友牺牲，临终前传递出关键情报——日军计划在华北地区投放细菌弹。
为阻止阴谋，小队冒险突袭日军军火库，却发现所谓“军火”实为细菌武器的运输车辆。廖武决定改变计划，将目标锁定在细菌弹的生产源头——“731”基地核心实验室。队员们分工协作：阿玉负责制造混乱引开守卫，李银龙破基地电网系统，陈秋雪则利用医学知识找到病毒样本的储存位置。最终，小队成功炸毁实验室，销毁病毒资料，但廖武在掩护撤离时与松井同归于尽。
故事，幸存的陈秋雪和李银龙带着未成的任务继续潜伏，暗示“天狼星”的使命仍在延续。剧情通过紧凑的任务推进和复杂的人物关系，展现了抗日志士在绝境中的勇气与牺牲，同时揭示了战争背后人性的挣扎与光辉。