幼年时，宇智波一族遭遇灭族惨案，7岁的佐助亲眼目睹兄长宇智波鼬屠杀全族，从此将“杀死鼬”刻为生存的唯一意义。他在忍者学校以顶尖成绩毕业，与漩涡鸣人、春野樱同属第七班，师从旗木卡卡西。初期展现出卓越的天赋与冷静的性格，但对力量的极致渴望使他逐渐与同伴产生隔阂。
为追求复仇所需的力量，佐助叛离木叶，投奔“晓”组织成员大蛇丸。在大蛇丸的基地中，他成咒印的掌控与身体改造，实力大幅提升。终结之谷一战，他与鸣人展开生死对决，虽击败对方却未下杀手，最终选择独自踏上复仇之路。
随着剧情推进，佐助得知灭族真相：鼬实为木叶高层命令下的“守护者”，屠杀全族是为保护村子与弟弟。真相击碎佐助的复仇执念，他转而以“摧毁木叶”为新目标，与“晓”残余势力合作，参与第四次忍界大战。
战斗中，佐助的写轮眼进化为万花筒写轮眼，觉醒须佐能乎，掌握天照、加具土命等秘术。他与鸣人并肩对抗大筒木辉夜，成为“忍界双雄”之一。战后，佐助选择赎罪之旅，遍历忍界了各国疾苦，最终回归木叶，成为暗中守护村子的“影子”。
能力上，佐助精通火遁豪火球之术与雷遁千鸟/麒麟，写轮眼具备复制忍术、洞察破绽的能力，万花筒更赋予空间移动左眼加具土命，右眼天照。须佐能乎形态随实力增强不断进化，最终达到全体，可施展因陀罗之矢等奥义。
性格上，佐助早期冷酷孤僻，视力量为唯一信仰；经历真相与战争后，逐渐理“羁绊”的意义，变得沉稳内敛，以行动守护所爱之人。他与鸣人的关系从宿敌到挚友，成为彼此最坚实的后盾。
新时代的佐助，作为木叶高层顾问与宇智波一族代表，继续以自己的方式守护忍界和平，其传奇经历仍在忍界流传。