在化学性质上，磷酸氢根离子具有两性特征。它既能在溶液中电离出氢离子H⁺，表现酸性：HPO₄²⁻ ⇌ H⁺ + PO₄³⁻；也能接受氢离子形成磷酸二氢根H₂PO₄⁻，表现碱性：HPO₄²⁻ + H⁺ ⇌ H₂PO₄⁻。这种特性使其成为生物体内重要的缓冲物质，例如在人体血液中，HPO₄²⁻与H₂PO₄⁻组成缓冲对，共同维持血液pH值的稳定。
磷酸氢根离子的电离常数Ka为6.23×10⁻⁸，水常数Kh为1.61×10⁻⁷，水倾向大于电离倾向，因此其水溶液呈弱碱性。在实验室中，磷酸氢盐如磷酸氢二钠Na₂HPO₄常用作缓冲剂，调节溶液酸碱度。在自然界中，磷酸氢根广泛存在于磷矿石、土壤及生物体内。它是植物生长必需的营养成分之一，通过根系被吸收后参与核酸、磷脂和ATP的合成。在人体中，骨骼和牙齿的主要成分羟基磷灰石[Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂]也包含磷酸根离子，而磷酸氢根是骨组织矿化过程的重要产物。
磷酸氢根离子的稳定性受pH值影响显著。在强酸性条件下，它会结合氢离子转化为H₂PO₄⁻或H₃PO₄；在强碱性条件下，则进一步电离为PO₄³⁻。这种转化关系构成了磷酸的三级电离平衡系统，在工业废水处理、肥料生产和生物化学研究中具有重要应用价值。
作为一种多用途的机离子，磷酸氢根在维持生态系统磷循环、保障生物体能量代谢以及工业生产过程中均发挥着不可替代的作用。其独特的化学性质使其成为连接机化学与生命科学的重要桥梁。