大蛇丸叛逃木叶后，一直觊觎宇智波一族的写轮眼，他选中佐助作为自己的“容器”，企图通过夺舍获得更强大的力量。为此，他收佐助为徒，传授其禁忌忍术，同时也在暗中侵蚀佐助的意识。随着佐助实力的增长，他逐渐摆脱大蛇丸的控制，并决心亲手了结这段扭曲的师徒关系——他要杀死大蛇丸，夺取对方积累的所有力量。
第334集中，大蛇丸因长期使用禁术导致身体虚弱，正处于每隔一段时间就需要更换容器的“虚弱期”。佐助抓住这个机会，主动向大蛇丸发起挑战。战斗中，佐助不再隐藏实力，他用写轮眼看穿大蛇丸的蛇类忍术，以雷遁·千鸟贯穿大蛇丸的身体。面对佐助的决绝，大蛇丸试图用八岐之术反抗，却被佐助的须佐能乎雏形压制。最终，佐助彻底吞噬了大蛇丸的查克拉，将其意识封印在自己体内，大蛇丸的物理形态宣告“死亡”。
尽管此后大蛇丸在剧情中多次以不同形式复活如通过兜的身体、药师兜的“仙人模式”等，但第334集是他作为独立个体第一次被“杀死”的关键节点。这场战斗不仅让佐助获得了大蛇丸的力量，也为他后续加入“晓”、向鼬复仇埋下伏笔，成为《火影忍者》中忍界变革的重要转折点。