第一次死亡：被佐助以咒印之力反噬吞噬
大蛇丸为追求永生，长期研究“不死转生”之术，试图夺取拥有强大血脉的忍者身体作为容器。宇智波佐助因灭族仇恨投靠大蛇丸，成为他选中的下一个目标。在大蛇丸准备实施转生仪式时，因长期使用禁术身体早已虚弱，而佐助在这段时间通过训练和咒印的力量不断成长，实力反超。仪式进行到关键时刻，佐助突然爆发，以自身意志掌控咒印力量，将大蛇丸从体内强行剥离并吞噬。这场反噬让大蛇丸失去了主导意识，身体被佐助的咒印能量彻底压制，第一次“死亡”随之降临。不过，大蛇丸的灵魂并未全消散，其意志残留在佐助体内的咒印中，成为潜在的隐患。
第二次死亡：宇智波鼬以十拳剑将其永久封印
大蛇丸的意志在佐助体内蛰伏多年，直至佐助与宇智波鼬决战时，因佐助查克拉耗尽而再次苏醒，试图夺取佐助的身体。然而，这一次他面对的是早已洞悉一切的鼬。鼬为彻底清除大蛇丸对弟弟的威胁，使用了宇智波一族的秘传忍术“须佐能乎”，其手中持有的神器“十拳剑”拥有封印万物的力量。当大蛇丸从佐助体内钻出的瞬间，鼬的须佐能乎抓住机会，以十拳剑直接刺穿大蛇丸的身体。十拳剑的特性是将被刺中的对象封印进醉梦般的幻术世界，永世法脱身，这一次大蛇丸的灵魂与肉体被彻底封印，真正意义上的“死亡”终告实现。
大蛇丸的两次“死亡”，本质上是他咎由自取的结果：对佐助的过度自信让他死于亲手培养的“容器”反噬，对鼬的轻视则让他最终败于血脉亲人的封印之剑。这两次终结，不仅终结了他的不死执念，也为忍界消除了一个贯穿数十年的威胁。