混乱中，十二名身着旗袍、妆容艳丽的秦淮歌女闯入教堂。她们曾是秦淮河上的“商女”，玉墨倪妮 饰是她们的大姐，泼辣又重情义。歌女们的到来打破了教堂的平静，女学生们对这些“风尘女子”充满鄙夷，双方矛盾不断：学生嫌她们吵闹，歌女笑学生迂腐，约翰则夹在，一边想脱身，一边又被眼前的苦难触动。
日军的暴行步步紧逼，他们发现了教堂里的女学生，强令她们在圣诞夜前往日军司令部“慰劳”士兵。女学生们陷入绝望，甚至想以死抗争。此时，玉墨看着这些与自己妹妹年纪相仿的女孩，内心受到巨大冲击。她召集姐妹们，说出了一个震撼所有人的决定：歌女们代替女学生赴宴，用自己的方式保护这些孩子。
为了让伪装更逼真，约翰放弃了离开的念头，他剪掉长发，穿上神父的服装，为歌女们化装成学生模样。歌女们褪去华服，换上朴素的校服，她们教学生唱《秦淮景》，学生们则为她们系上领巾。曾经的隔阂在生死面前消弭，商女与学生，在绝境中达成了最悲壮的和。
圣诞夜，日军的卡车停在教堂外。十三名“女学生”十二名歌女加孟先生的女儿书娟，书娟为凑齐人数主动加入整理好衣着，在玉墨的带领下登上卡车。她们回头望向教堂，脸上没有恐惧，只有决绝。约翰站在窗前，看着卡车消失在夜色中，泪水滑落。她们用生命践行了“商女亦知亡国恨”的悲壮，为女学生们换来了一线生机。
影片最后，女学生们在约翰的保护下逃离南京，而十三钗的结局则定格在驶向未知的卡车背影中，留下尽的唏嘘与震撼。