目的蛋白提取是Western Blotting实验的首个关键环节，直接影响后续蛋白分离、检测的准确性与可靠性。其核心目标是从细胞或组织样本中高效分离并稳定保存目的蛋白，同时去除干扰物质。
实验开始前需根据样本类型选择处理方式。对于贴壁细胞，需用预冷的PBS洗涤2-3次，以去除培养基残留；加入适量裂液后，冰上静置10-15分钟，期间轻柔晃动使裂充分，随后用细胞刮勺收集裂液。悬浮细胞则通过离心1000×g，5分钟沉淀后，同样用PBS洗涤并加入裂液处理。若样本为动物组织，需先在液氮中快速研磨成粉末，避免蛋白降，再按比例加入裂液，冰上匀浆或超声破碎，确保组织彻底裂。
裂液的选择需依据蛋白特性调整。常用RIPA裂液含Tris-HClpH 7.4、NaCl、NP-40、脱氧胆酸钠等成分，可有效溶大部分可溶性蛋白；若目的蛋白为膜蛋白，需添加去污剂如SDS或CHAPS以增强溶性。同时，裂液中需加入蛋白酶抑制剂如PMSF、蛋白酶抑制剂 cocktail和磷酸酶抑制剂如Na₃VO₄、NaF，分别防止蛋白水和去磷酸化。
裂成后，样本需经离心处理12000×g，4℃，15-20分钟，取上清液即为总蛋白提取物。离心步骤可去除细胞碎片、核物质及不溶性杂质，避免对后续电泳造成干扰。对于高黏度样本，可适当延长离心时间或提高转速。
蛋白提取后需进行浓度测定，常用BCA法或Bradford法。取少量上清液与检测试剂反应，通过分光光度计读取吸光度，根据标准曲线计算蛋白浓度。此步骤确保后续上样量的准确性，避免因蛋白过量或不足导致条带失真。
最后，按比例加入5×SDS上样缓冲液含β-巯基乙醇或DTT，95℃煮沸5-10分钟使蛋白变性。变性后的样本可立即用于电泳，或分装后-80℃冻存，避免反复冻融影响蛋白稳定性。
整个提取过程需全程保持低温操作，所有试剂和容器提前预冷，以降低蛋白酶活性，减少蛋白降。同时，严格控制裂时间和力度，避免剧烈操作导致蛋白变性或片段化。目的蛋白提取的效率与质量，直接决定Western Blotting实验的最终成败，需通过优化裂条件、选择合适试剂等方式，确保目的蛋白的整性与活性。