如何进行质粒提取？

准备工作 提前准备：含目标质粒的大肠杆菌菌株、LB液体培养基添加对应抗生素，如氨苄青霉素100 μg/mL、质粒提取试剂盒含裂液P1、裂液P2、中和液P3、洗涤液WB、洗脱液EB、1.5 mL菌离心管、移液器1 mL/200 μL/10 μL、台式冷冻离心机需4℃预冷、振荡器、超净工作台。

步骤1：培养菌液，收集菌体 1. 用灭菌牙签挑取单菌落，接种至5-10 mL LB培养基中，37℃恒温摇床，200-220 rpm培养12-16小时菌液呈浑浊淡黄色，OD600≈0.6-0.8最佳。 2. 取1.5 mL菌液至离心管，4℃，8000 rpm离心5分钟，弃上清管壁可见白色菌体沉淀。

步骤2：裂菌体，释放质粒 1. 向菌体沉淀中加入250 μL裂液P1含RNase A，用振荡器充分混匀至沉淀全散开明显结块。 2. 加入250 μL裂液P2含SDS和NaOH，轻柔颠倒离心管8-10次切勿剧烈震荡！避免基因组DNA断裂，室温静置1-2分钟溶液呈透明黏稠状，菌体彻底裂。

步骤3：中和反应，沉淀杂质 立即加入350 μL中和液P3含醋酸钾，快速颠倒离心管10-15次可见白色絮状沉淀，为蛋白质和基因组DNA，4℃，12000 rpm离心10分钟沉淀集中于管底，上清液清亮。

步骤4：吸附质粒，去除残留杂质 1. 将上清液约800 μL转移至吸附柱放入收集管，室温，12000 rpm离心1分钟质粒DNA结合至硅胶膜，弃穿透液。 2. 向吸附柱中加入500 μL洗涤液WB提前加水乙醇！，室温，12000 rpm离心1分钟洗去盐离子和蛋白残留，弃穿透液；重复洗涤1次。 3. 吸附柱放回收集管，12000 rpm离心2分钟彻底去除残留乙醇，避免影响后续实验。

步骤5：洗脱质粒，获得纯品 将吸附柱转移至新的1.5 mL离心管，向柱中央滴加50-100 μL洗脱液EB或菌去离子水，pH 8.0-8.5最佳，37℃孵育2分钟促进质粒DNA溶，12000 rpm离心1分钟，管底透明液体即为提取的质粒DNA。

关键提示

• 裂液P2接触空气易吸收CO₂，使用前需检查是否浑浊，若浑浊需弃用。
• 中和后离心必须彻底，否则上清含杂质会影响吸附效率。
• 洗脱液用量可根据需求调整：50 μL浓度高，100 μL产量高。