如何进行PCR反应与凝胶电泳实验操作示范？

1. 实验准备 提前准备试剂与器材：模板DNA、2×PCR Master Mix含Taq酶、dNTP、缓冲液、上下游引物、ddH₂O、PCR管、微量移液器、离心机。*所有试剂需4℃冷藏保存，取出后立即置于冰盒*。

2. 反应体系配置20μL体系 在PCR管中按顺序加样：*2×PCR Master Mix 10μL*、*上游引物10μM0.5μL*、*下游引物10μM0.5μL*、*模板DNA 1μL*、*ddH₂O 8μL*。加样后轻弹管壁混匀，*瞬时离心3000rpm，10s* 确保液体沉于管底。

3. PCR仪程序设置 按以下参数设置扩增程序：*预变性95℃ 5min*；*循环阶段30-35次：变性95℃ 30s，退火55-65℃根据引物Tm值调整30s，延伸72℃ 1min/kb按产物长度调整*；*终延伸72℃ 10min*；4℃保存。将PCR管放入仪器，启动程序。 二、凝胶电泳操作

1. 琼脂糖凝胶制备 称取*1g琼脂糖*，加入100mL 1×TAE缓冲液，微波炉中高火加热至全溶中途轻摇避免沉淀。冷却至50-60℃时，加入*EB染液终浓度0.5μg/mL*，轻轻混匀后倒入胶槽，插入梳子，室温静置20-30min至凝胶凝固。

2. 样品与Marker准备 取*5μL PCR产物*与*1μL 6×上样缓冲液*含溴酚蓝指示剂充分混匀，另准备*5μL DNA Marker*用于分子量参照。

3. 上样与电泳 将凝胶放入电泳槽，倒入1×TAE缓冲液至液面没过胶面2mm。小心拔出梳子，用微量移液器将样品与Marker缓慢加入加样孔避免样品溢出。*设置电压120V，电泳时间35min*观察溴酚蓝指示剂迁移至凝胶2/3处停止。

4. 结果观察 电泳后，将凝胶转移至紫外透射仪下，开启紫外灯。*根据Marker条带位置判断产物大小，清晰单一的目标条带为阳性结果*，弥散带或条带提示扩增失败。